細(xì)心地進行引物設(shè)計是PCR 中zui重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同時擴增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：

1）典型的引物18 到24 個核苷長。引物需要足夠長，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24 核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。

2）選擇GC 含量為40％到60％或GC 含量與模板GC 含量接近的引物。

3）設(shè)計5'端和中間區(qū)為G 或C 的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。

4）避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。在用軟件設(shè)計時大家常常會疑惑，究竟G 不能低于多少?這里有個數(shù)據(jù):G 為0~-2時，PCR 產(chǎn)率可達100%， G=-6 時，為40%。

5）避免3"末端富含GC。設(shè)計引物時保證在zui后5 個核苷中含有3 個A 或T。

6）避免3"末端的錯誤配對。3"端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’以G或C 結(jié)尾，防止AT 的松散結(jié)合引起錯配。

7）避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。

8）引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA 分子時的溫度。兩引物的Tm 值相差不應(yīng)大于5℃。計算Tm 有幾種公式。*個公式（Wallace 規(guī)則）:Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T），這來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于15-20個堿基的引物，也適用于手工設(shè)計時的簡單計算。第二個公式（Baldino 算法）適用于計算14-70個核苷酸在≤0.4mol\L 的陽離子溶液中的Tm， 也可用于擴增產(chǎn)物的Tm 計算.Tm=81.5+16.6*lg[K+]+0.41（%[G+C]）-（675/n）。以上兩種算法都是基于堿基組成而不是堿基排列而計算的，事實上相同堿基組成的引物Tm 可能差異不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一樣的，所以確定引物Tm zui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序如Primer5 等均使用近鄰分析法。

9）當(dāng)在引物5’端添加酶切位點時要考慮：a）該目的序列內(nèi)部不得含有相同的酶切位點，在引物發(fā)出后才發(fā)現(xiàn)錯誤的事情本人就干過，在論壇上也能看到這樣的粗心人。這樣的錯誤會給將來的克隆造成麻煩。b）如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位點的外側(cè)再加上保護堿基，不同的酶對于保護堿基的要求是不同的。如果不設(shè)計保護堿基，則多半要用TA 克隆的方式連接到質(zhì)粒上，這時要注意Taq 酶的選擇，這一點在后面再聊。若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5"端而不影響特異性。當(dāng)計算引物Tm 值時并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進行互補性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。

10）有時候，對于引物設(shè)計僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。特別要注意的是：不要在引物的3"端使用兼并堿基，因為3"端zui后3 個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1µM 到3µM），因為許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。說了半天了，想起來還得提醒大家一句:千萬別搞錯了引物的位置！這句話似乎多余。

看了上面的圖吧，如果要擴增目的序列為“ATG…………TGA”的片段，則引物分別為“ATG……”和“TCA……”仔細(xì)琢磨一下，特別是5’端再接上酶切位點可別搞錯了！合成錯了一條可就是50 塊錢，到時候挨老板批的時候別怪我沒提醒你哦：）設(shè)計好了引物就要讓公司合成，這時候別忘了談價格：）現(xiàn)在競爭很厲害，價格已經(jīng)挺便宜了，注意兩個參數(shù)：一個是OD 值，如果公司說1OD 能比2OD 優(yōu)惠，那通常1OD 足夠了。第二是純度，是HPLC 的還是OPC 的，事先要說好，引物設(shè)計方面還有很多話題可說，比如如何利用引物搭橋?qū)蓚€片段通過PCR 而不是酶連接起來、如果要設(shè)計引物表達蛋白時注意“N 端規(guī)則”。