磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中（圖3）。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

方法

1、懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5~1×10⁶）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul,室溫避光30min,再加入PI（50ug/ml）5ul,避光反應(yīng)5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)（一般不超過(guò)1h）， 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照。

2、貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。

3、爬片細(xì)胞染色：同上，zui后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。

注意事項(xiàng)

1. 整個(gè)操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞。

2. 操作時(shí)注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。