用elisa試劑盒檢測(cè)樣本的原理和步驟

ELISA法定量檢測(cè)人細(xì)胞液、體液以及組織勻漿中8羥基脫氧鳥(niǎo)苷的含量。

試劑組成

包被平底微孔板,酶結(jié)合物,生物素,標(biāo)準(zhǔn)品,顯色劑A,顯色劑B,終止液,濃縮洗滌液（100倍稀釋）,使用說(shuō)明書

自備物品

1.酶標(biāo)儀（盡量提前預(yù)熱）

2.微量加液器、吸頭

3.蒸餾水或去離子水以及濾紙

樣本的采集及保存

一般的生物標(biāo)本包括有：

血液、體液、內(nèi)臟器官、糞便、胃液、活檢組織、組織提取液、天然孔分泌物及各種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物等

一般為無(wú)菌操作，低溫保存（-80℃、液氮）

一．如果采集的實(shí)質(zhì)器官則要求：

1、   器官實(shí)質(zhì)不能太小

2、   以采集實(shí)質(zhì)性病灶區(qū)為佳：如淋巴結(jié)、心臟、非、肺、脾以及腸管等病毒、病菌聚集的地方為佳

3、   同一病例裝入同一容器，并做好標(biāo)記

4、   應(yīng)在0-8℃的低溫儲(chǔ)存和運(yùn)輸

5、   實(shí)質(zhì)性器官的處理：

5.1、取實(shí)質(zhì)性器官約0.5mg左右，充分剪碎或研磨

5.2、加入約500ul的PBS/生理鹽水，充分混勻

5.3、離心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作為待檢標(biāo)本（切勿反復(fù)凍融）

二．體液（常見(jiàn)的包括血清、血漿、唾液以及尿液等）的處理方式

1、血液包括血漿和血清，它們的主要區(qū)別就是：血清凝血而血漿不凝血，所以它們的處理方式也就不一樣

1.1、采集血漿時(shí)一般不加抗凝劑（主要為枸櫞酸鹽和檸檬酸鹽），采集后立即離心800-1000rmp x 5min分離，取上清，-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/span>

1.2、如要采集血清，一般要加入總體積1%的抗凝劑，采集后先室溫或4℃靜置半小時(shí)后，800-1000rmp x 5min分離，取上清，-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/span>

2、胃液和唾液的采集方式一般現(xiàn)采現(xiàn)用，但是一般飯后半小時(shí)內(nèi)不易采集，因?yàn)閯傔M(jìn)食的唾液中富含豐富的唾液淀粉酶，的采集的時(shí)間時(shí)空腹采集；

3、尿液的采集方式基本和唾液一樣的，即現(xiàn)采現(xiàn)用，但是一般隔夜尿不采集；

4、組織提取液如肺泡灌洗液等，采集后離心分離，800-1000rmp x 5min，取上清，-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/span>

三．糞便以及天然孔排泄物：采集后一般現(xiàn)用PBS/生理鹽水溶解，充分混勻，800-1000rmp x 5min分離，取上清，-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/span>

四．活檢組織一般進(jìn)行穿刺檢測(cè)，zui常見(jiàn)的就是肝活檢，像病毒性肝炎、脂肪肝、各種類型的肝硬化等進(jìn)行活檢簡(jiǎn)單方便、準(zhǔn)確。

三、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

（一）真核表達(dá)產(chǎn)物

1、   細(xì)胞上清（分泌性蛋白）

1.2、貼壁細(xì)胞或半貼壁，直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，-20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

1.2、不貼壁細(xì)胞，將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管，500-800rmp x10min，吸取上清至另一10ml離心管中，10000rmp x10min， -20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

2、   細(xì)胞裂解物（非分泌性蛋白）

2.1、貼壁細(xì)胞或半貼壁，直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出，然后用001M PBS（pH 7.4）將細(xì)胞吹下至10ml離心管，500-800rmp x10min，棄上清，沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中， DDW重懸，置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解，10000rmp x10min，取上清，-20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

2.2、不貼壁細(xì)胞，將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管，500-800rmp x10min，棄上清，沉淀移至另一10ml離心管中，0.01M PBS（pH 7.4）重懸，500-800rmp x10min，棄上清，沉淀移至1.5ml離心管中， DDW重懸，置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解，10000rmp x10min，取上清， -20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

（二）原核（大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)）表達(dá)產(chǎn)物

1、表達(dá)上清（非融合性蛋白）

直接將培養(yǎng)物和上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，-20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

2、菌體裂解物（融合性蛋白）

直接將培養(yǎng)物和上清吸出，10000rmp x10min，棄上清，沉淀用PBS洗一遍，500-800rmp x10min，棄上清，DDW重懸沉淀，冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解，10000rmp x10min，取上清，-20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

注意事項(xiàng)

1.試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書要求保存。實(shí)驗(yàn)操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。

2．加樣：加樣時(shí)，要控制加樣速度，避免*孔與zui后一孔之見(jiàn)的時(shí)間間隔過(guò)大，否則將會(huì)導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時(shí)間，從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性；一般加樣時(shí)間控制在10分鐘內(nèi)，如果樣本數(shù)量過(guò)多，可使用多道移液器。

3.孵育：樣品要在密閉的容器內(nèi)進(jìn)行孵育，嚴(yán)格按照說(shuō)明書上規(guī)定的孵育時(shí)間和溫度進(jìn)行。

4.洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中的殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5.反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

6.建議實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，計(jì)算結(jié)果時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

7.建議使用本試劑盒時(shí)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)（即先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，試用幾個(gè)標(biāo)本），如果對(duì)本試劑盒有任何疑問(wèn)，可和所購(gòu)經(jīng)銷商，如果因運(yùn)輸過(guò)程導(dǎo)致試劑盒失效，可要求調(diào)換，但概不承擔(dān)產(chǎn)品本身以外的任何損失。

操作步驟

1.          取出試劑盒，于室溫（20-25℃）放置15-30分鐘。實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在室溫（20-25℃）內(nèi)進(jìn)行。

2.          取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中。

3.          空白微孔中加入50μl的樣品，空白對(duì)照加入50μl的蒸餾水；

4.          在樣品孔中加入10μl的生物素；（不含空白對(duì)照孔,切忌：生物素只加樣品孔?。?/span>

5.          在各孔中加入100μl的酶標(biāo)記溶液；（不含空白對(duì)照孔）

6.          將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育反應(yīng) 1小時(shí)；（在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度）

7.          充分清洗酶標(biāo)板3-5次，保持各孔有充足的水壓；（濃縮洗滌液以1：100的比例與蒸餾水稀釋）

8.          酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙*拍干；

9.          各孔加入顯色劑A、B液各50μl；（不含空白對(duì)照孔）

10.       20-25℃下避光反應(yīng)15分鐘；

11.       各孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)；

結(jié)果判斷

1.          30分鐘內(nèi)在波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值；

2.          以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖；

3.          根據(jù)樣品的OD值查找對(duì)應(yīng)的濃度范圍；

4.          敏感度：0.1 ng/ml